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熒光免疫染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

免疫熒光是一種將抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法。該法把血清學(xué)的特異性、熒光色素的敏感性、顯微鏡檢查法集為一體,擴(kuò)大了免疫學(xué)診斷的效果,是近代免疫學(xué)的一種重要研究手段。抗體球蛋白標(biāo)記上熒光色素,即成為熒光抗體。熒光免疫染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

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  • 更新時(shí)間:2024-10-15
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詳細(xì)介紹

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  • 熒光免疫染色服務(wù)介紹
  • 熒光免疫染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

 

免疫熒光是一種將抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法。該法把血清學(xué)的特異性、熒光色素的敏感性、顯微鏡檢查法集為一體,擴(kuò)大了免疫學(xué)診斷的效果,是近代免疫學(xué)的一種重要研究手段??贵w球蛋白標(biāo)記上熒光色素,即成為熒光抗體。這是利用某些熒光色素在一定條件下可與抗體分子結(jié)合,但不影響抗體的免疫活性。用熒光抗體浸染可能含抗原的細(xì)胞或組織切片,如有相應(yīng)抗原存在,則抗原與標(biāo)記抗體特異性結(jié)合,形成的免疫復(fù)合物固定于細(xì)胞上,不容易洗脫,在熒光顯微鏡下成為發(fā)出熒光的可見物體,可達(dá)到診斷及定位的目的。

 

  • 熒光免疫染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè),熒光免疫染色實(shí)驗(yàn)原理

 

將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物,再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色),可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。

 

三、,實(shí)驗(yàn)流程

免疫熒光單標(biāo)記方法

免疫熒光單標(biāo)記是指只標(biāo)記一種蛋白質(zhì)分子,方法比較簡(jiǎn)單,只要按照染色步驟去做,通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇,固定液選擇的合適與否,可能會(huì)直接影響染色結(jié)果。具體染色方法如下。

1、所需材料與試劑

a, 培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達(dá)到60%-70%的細(xì)胞。

b, 一抗、FITC或TRITC標(biāo)記的二抗。

c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預(yù)冷20 min)。

d, 封閉液。

e, 0.01mol/LPBS緩沖液。

2、染色方法

a, 取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿,用0.01MPBS洗2-3遍。

b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

c, 加入4%多聚甲醛試問固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

d,正常阻斷血清1:20封閉試問20-30 min,抑制IgG的非特異性結(jié)合。阻斷血清必須選擇與二抗同一種屬的正常血清。

e, 去掉正常血清,直接加入一抗,37℃孵育1 h或4℃過夜??贵w以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗(yàn)而定)。

f, 0.3% TritonX-100洗5 min,0.01 mol/IPBS洗5 min,0.3% TritonX 5 min,0.01 M PBS洗5 rain。

g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗,37℃,孵育1h。

h, 0.3%TritonX-100洗5rain,0.01 mol/LPBS洗5min,0.3% Triton X 5min,0.01mol/LPBS洗5 min,用濾紙吸干。

i, 90%甘油(PBS配制)封片。

j, 激光掃描共焦顯微鏡下觀察,或于4℃避光保存。

免疫熒光雙標(biāo)記方法

免疫熒光的雙標(biāo)記是指同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子,當(dāng)懷疑某種配體與已知受體結(jié)合后可用此方法加以證明。此方法稍微復(fù)雜一些,首先應(yīng)注意所用的一抗必須是來自不同種屬動(dòng)物的兩種特異性抗體(例如:A抗體為多克隆抗體,來自家兔;B抗體為單克隆抗體,來自小鼠)。其次,兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應(yīng)重疊,且盡量遠(yuǎn)離,通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5,或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下,染色時(shí)兩種一抗可以同時(shí)孵育,然后可以同時(shí)孵育兩種二抗。但當(dāng)染色結(jié)果一種顏色非常弱,而另一種顏色比較強(qiáng)時(shí),應(yīng)考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標(biāo)記。

 

四、客戶提供

細(xì)胞株或細(xì)胞爬片。(注:細(xì)胞爬片不宜太密;細(xì)胞必須固定。)組織切片,一抗

 

五、公司提供

實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)試劑、樣品處理、圖片及圖片分析,熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡拍攝

熒光免疫染色

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