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上海信帆生物:酶聯(lián)免疫吸附檢測法

更新時間:2016-05-07      瀏覽次數(shù):1361

一、原理

植物激素(planthormone)免疫定量主要有放射免疫分析(RIA)和酶聯(lián)吸附免疫分析(ELISA),由于前者操作上欠安全等原因,目前常采用后一種類型。在ELISA中,抗原抗體反應的檢測依靠酶標記物來實現(xiàn),常用的酶有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酯酶。酶可直接標記激素分子,稱為酶標植物激素,也可標記于第二抗體(識別抗激素抗體Fc片段的抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白),稱為酶標二抗。這兩類標記物分別用于固相抗體型和固相抗原型ELISA。A.固相抗體型ELISA:將抗激素的單克隆抗體(Mab)與已吸附于固相載體上的兔抗鼠Ig抗體(RAMIG)結(jié)合,然后加入激素標準品或待測樣品,使其與固相化的Mab結(jié)合, 再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記激素(酶標激素)。通過測定酶標激素的被結(jié)合量,可換算出未知樣品中激素的數(shù)量。B.固相抗原型ELISA:將“激素-蛋白”復合物(該蛋白應不同于免疫原中的載體蛋白)包被于固相載體,加入待測激素(樣品或標準品)和抗IAA多克隆抗體(Pab)反應,進行競爭反應。然后讓HRP標記羊抗兔Ig抗體(HRP-GARIG)與結(jié)合在固相上的Pab反應,通過測定與固相結(jié)合的酶量,換算出未知樣品中激素的含量。

二、材料、儀器設(shè)備及試劑 

(一)材料:高等植物、真菌、藻類等組織或器官。

(二)儀器設(shè)備:1. 酶聯(lián)免疫檢測儀;2. 高速冷凍離心機;3. 恒溫箱;4. 連續(xù)進樣器;5. 渦旋儀;6. 96孔微孔板;7. 離心管;8. 研缽或勻漿器;9. 試管。

(三)試劑1. 洗滌緩沖液:0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液(PBS),含0.05%Tween-0;2. RAMIG溶液,或“激素-蛋白”復合物;3. 0.1%封閉蛋白(該蛋白應不同于免疫原中的載體蛋白);4. 抗激素Mab,或Pab;5. 激素標準品母液,及參比系列溶液(按雙倍或四倍系列稀釋);6. HRP標記激素,或HRP-GARIG;7. 鄰苯二胺(OPD)基質(zhì)液:5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS,用前加入30%H2O212.5μl。

三、實驗步驟 

固相抗體型elisa。
1. 用方陣法滴定選擇各反應物zui適工作濃度;
2. 將100μlRAMIG溶液包被聚苯乙烯反應板微孔,4℃濕盒,12h;
3. 棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗滌3次,甩干;
4. 加入100μl抗激素Mab溶液,37℃70min;

 

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