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產(chǎn)品分類上海信帆生物組織開展了:細(xì)胞樣本的前處理和保存的培訓(xùn)活動
很多老師在收集樣本的時候,樣本是細(xì)胞樣本,不清楚應(yīng)該如何進(jìn)行前處理,如果保存,今天讓我們跟著上海信帆生物一起來了解一下細(xì)胞樣本的前處理方法吧!
一、勻漿介質(zhì)
一般采用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可根據(jù)樣本及測定指標(biāo)的情況自行設(shè)定濃度,目的是保持樣本的等滲環(huán)境。
二、細(xì)胞樣本的前處理:
1、細(xì)胞沉淀的收集:
① 懸浮細(xì)胞: 對于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,直接通過離心收集細(xì)胞沉淀,將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘,棄上清留細(xì)胞沉淀。
② 貼壁細(xì)胞: 對于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞,用胰酶將細(xì)胞消化下來,或用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下來,將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘,棄上清留細(xì)胞沉淀。
我們一般建議客戶,細(xì)胞密度好不要小于一百萬個/ml。
2、細(xì)胞沉淀的洗滌:
在細(xì)胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS (等滲), 輕輕顛倒混勻,將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘,棄上清留細(xì)胞沉淀。
重復(fù)上述操作反復(fù)洗滌1~2次。
3、勻漿的方式:手工勻漿,超聲破碎,裂解液裂解,反復(fù)凍融。
① 手工勻漿:在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據(jù)所測指標(biāo)的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細(xì)胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細(xì)胞懸浮于PBS中,用移液器將細(xì)胞懸浮液移至玻璃勻漿管中(2ml玻璃勻漿管),將玻璃勻漿管置于冰水混合物中,手動勻漿3分鐘,然后取破碎好的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行測定。
② 超聲破碎:
在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據(jù)所測指標(biāo)的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細(xì)胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細(xì)胞懸浮于PBS中,在冰水浴條件下進(jìn)行如下操作:
a、用超聲粉碎機進(jìn)行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎,也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀,用400安培,5秒/次,間隙10秒反復(fù)3~5次。
b、用超聲細(xì)胞破碎儀,300W功率,每次超聲3~5秒,間隔30秒,重復(fù)4~5次。
③ 裂解液裂解
常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,這三種去垢劑的作用是不同的,或者說作用力量強弱不同。
1、SDS屬于離子型去垢劑,厲害,基本可以把細(xì)胞*破掉,DNA會釋放出來,裂解液變得很粘稠。
2、NP-40是很溫和的去垢劑,1%濃度的基本可以破壞掉胞膜,而對核膜破壞的作用弱,結(jié)合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。
3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間,偏向于NP40,也是常用的細(xì)胞裂解液成分之一,在保護(hù)蛋白活性方面有一定作用(SDS基本會使蛋白變性失活)。
去垢劑屬性只是一方面,buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關(guān)鍵因素
由于很多裂解液都是蛋白變性劑,對酶活力的測定有一定的影響,一般不推薦用裂解液進(jìn)行裂解。
④ 反復(fù)凍融:
在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據(jù)所測指標(biāo)的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細(xì)胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細(xì)胞懸浮于PBS中,放低溫冰箱中結(jié)冰,溶解,再結(jié)冰,再溶解,反復(fù)3次左右)。
由于反復(fù)凍融對酶活力影響較大,一般不推薦使用
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